高中生物人教版（2019）选择性必修三3.2 基因工程的基本操作程序 优质课件（55张ppt）

3.2 基因工程的基本操作程序
DNA合成仪
显微注射技术
从社会中来
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉与普通棉花
培育转基因抗虫棉的简要过程：
提取
棉花细胞(含抗虫基因)
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
与运载体DNA拼接
导入
普通棉花(无抗虫特性)
棉花植株(有抗虫特性)
3.2 基因工程的基本操作程序（四个步骤）
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
前提
核心
关键
保证
一、目的基因的筛选与获取
1.目的基因：
主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
2.实例：
3.基因结构：
与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因）
与优良品质相关的基因
与生物药物和保健品相关的基因（胰岛素、干扰素基因）
与毒物降解相关的基因
与工业用酶相关的基因等
原核细胞的基因结构
真核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录
编码区
原核生物基因
终止子：终止转录
补充知识：基因结构：
非编码区
组成：编码区上游与编码区下游
功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
启动子：RNA聚合酶结合位点 转录起始的信号
终止子：终止RNA的合成
编码区：编码蛋白质的合成
加 工
转 录
mRNA前体
成熟mRNA
真核细胞的基因
非编码区
非编码区
编码区
与RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
1
2
3
4
5
启动子
终止子
补充知识：基因结构：
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞
真核细胞
不同点
编码区是_____的
编码区是间隔的、_____的
相同点
都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的
连续
不连续
编码区
非编码
注意
1、非编码序列：
包括非编码区和内含子
2、编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因
结构一样长吗？
思考
从生物细胞中直接获取
人工合成
5.目的基因获取方法：
4．目的基因的来源：
（一）从基因文库中获取；
（二）通过DNA合成仪直接合成
（三）利用PCR技术扩增；
一、目的基因的筛选与获取
反转录法
据已知的氨基酸序列推测合成DNA
通过DNA合成仪合成
（一）从基因文库中获取目的基因
1.基因文库概念：
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
2.基因文库类型：
（未知序列）
基因组文库
部分基因文库
（包含一种生物的所有基因）
（cDNA文库）
（包含一种生物的一部分基因）
提取某种生物的全部DNA
一定大小的DNA片段
导入受体菌中储存
用适当的限制酶切
将DNA片段与载体连接
基因组文库
基因组文库的构建模式图
3.
成熟mRNA
成熟mRNA
cDNA文库
成熟mRNA
部分基因文库构建模式图
4.
5.基因组文库与cDNA文库的构建过程比较
cDNA文库
以原核生物为主
真核生物
人工合成
鸟枪法
基因组DNA文库
cDNA文库
6. 基因文库的构建过程
某生物体内全部DNA
许多DNA片段
受体菌群体
限制酶
与运载体 连接导入
基因组文库
某种生物某个时期的mRNA
cDNA
反转录
受体菌群体
与运载体 连接导入
部分基因文库（cDNA文库）
7. 基因组文库和部分基因文库的比较
文库类型
cDNA文库
基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
依据：目的基因的有关信息。
如：根据基因的核苷酸序列
基因的功能
基因在染色体上的位置
基因的转录产物mRNA
基因翻译产物蛋白质等特性
8、从基因文库中得到目的基因的方法
目的基因的mRNA
单链DNA (cDNA）
双链DNA
(即目的基因)
反转录
合成
（二）人工合成目的基因
1．反转录法：
2. 根据已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
推测
推测
目的基因
化学合成
3、人工合成法
DNA合成仪
1、前提：基因比较小、核苷酸序列已知
（序列已知）
2、方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？
1）DNA序列自动测序仪：
2）PCR技术：
对提取出来的基因进行核苷酸序列分析
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。
（三）.利用PCR获取和扩增目的基因
PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
1、 概念：
表3-1 DNA复制所需的基本条件
参与的组分
在DNA复制中的作用
解旋酶（体外用高温代替）
打开DNA双链
DNA两条母链
提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸
合成DNA子链的原料
DNA聚合酶
催化合成DNA子链
与两条母链结合的2种引物
使DNA聚合酶能够从引物3′端连接脱氧核苷酸
3、方式：
2、 条件
以指数方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）
2n
4、 PCR过程：
变性、复性、延伸三步曲
变性：90～95℃
复性：55～60℃
延伸：70～75℃
变性
复性
延伸
变性 （90--95℃）
复性
延伸
5?
5?
5?
5?
（55--60℃）
（70--75℃）
5、PCR 的一轮扩增
1.变性：目的基因DNA受热变性，解链为单链；
2.复性：引物与单链互补结合；
3.延伸：合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。
变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，
形成_________
b、复性（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板
结合，形成局部________。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的
________。
氢键
单链DNA
双链
DNA链
6、利用PCR获取和扩增目的基因过程：
A T C G A A T C G G T T
U A C C T T A G C C A A
DNA
聚合酶
母链
DNA
子链
DNA
引物
3′
3′
5′
5′
知识回顾---DNA复制过程
高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化
2） Taq DNA聚合酶的应用
DNA模板，四种脱氧核苷酸，分别与两条模板链相结合的两种引物，Taq 酶
4) PCR和细胞内复制的不同点
PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20
－30个脱氧核苷酸
1） DNA聚合酶特性
不能从头合成DNA，只有当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶才能从引物的3′端开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从子链的
5′端向3′端延伸
7、关于PCR的几点说明：
3) 缓冲液需要为PCR反应提供的物质
模板DNA
利用PCR获取和扩增目的基因过程：
50℃
引物1
引物2
DNA引物
95℃
利用PCR获取和扩增目的基因过程：
引物1
引物2
DNA引物
72℃
Taq酶
Taq酶
利用PCR获取和扩增目的基因过程：
72℃
第1轮结束
第2轮开始
利用PCR获取和扩增目的基因过程：
95℃
50℃
72℃
Taq
Taq
Taq
Taq
利用PCR获取和扩增目的基因过程：
72℃
第2轮结束
利用PCR获取和扩增目的基因过程：
利用PCR获取和扩增目的基因过程：
循环
次数
DNA数量
1
2
2
4
3
8
20
1,048,576
30
1,073,741,824
30次循环后靶序列扩增的数量
8、PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术
DNA复制
相同点
原则
原料
条件
不同点
解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
从基因文库中寻找
聚合酶链式反应（PCR）扩增
化学合成法
目的基因的核苷酸序列未知
目的基因的核苷酸序列已知
小结：获取目的基因的常用方法有哪些?
初始目的基因的来源
1. 从生物中直接获取
2. 人工合成
注意：要保持基因的完整性
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
1、目的：
2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2、组成：
a、目的基因
b、启动子
c、终止子
d、标记基因
使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以
遗传给下一代
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
注意：
②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。
④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
思考1：表达载体为什么一定要有启动子？
生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；
（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。
位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。
1、启动子：
操纵基 因
结构基因


启动子
RNA聚合酶
是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。
思考3：标记基因有什么作用？
思考2：终止子的作用是什么？

终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。
基因表达载体的构建过程
两个切口
获得目的基因
质粒
DNA分子
限制酶处理
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
一个切口
两个黏性末端
?思考?用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)
如何避免质粒的自我环化和目的基因反向连接的问题？
（一）转化：
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程
受体细胞
稳定
表达
（二）方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——感受态细胞
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
（1）农杆菌转化法
①特点：
Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
Ti质粒
目的基因
构建
表达载体
导入
植物细胞
插入
植物细胞染色DNA
表达
新性状
转入
农杆菌
②转化过程:
具有趋化性（酚）
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
（2）基因枪法
适用于单子叶植物
（3）花粉管通道法
在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
2.将目的基因导入动物细胞
方法：显微注射法
提纯含目的基因表达载体
受精卵
显微注射
移植到输卵管或子宫
受精卵发育
新性状动物
（2）操作:
显微注射技术
3.将目的基因导入微生物细胞
（1）微生物作受体细胞原因：
（2）常用法：
Ca2+处理
常用菌：
大肠杆菌
（增加细胞壁的透性，与细胞膜无关）
（3）过程：
Ca2+处理大肠杆菌
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。
受体生物
植物
动物
微生物
受体细胞
导入方法
受精卵
体细胞
受精卵
细胞/个体
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
显微注
射技术
用Ca2+处理成感受态细胞
小结：
四、目的基因的检测与鉴定
检测—
鉴定——
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
——检查是否成功
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插
入了目的基因
1、检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
① 首先取出转基因生物的基因组DNA；
（1）方法:
DNA分子杂交
（2）过程:
② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的
基因已插入染色体DNA中。
（一）检测
15N
15N
变性
变性
DNA变性、复性与分子杂交
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
①方法:
分子杂交
②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,
表明目的基因转录出了mRNA。
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原-抗体杂交
蛋白质
脱分化
提取
苏云金杆菌
Bt毒素蛋白
抗体
出现
杂交带
鉴定——
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆。
否则形成蓝色克隆。
典型例题