(共35张PPT)
基因工程
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。
1.别名：_____________
2.原理：_____________
3.操作对象：_________
4.操作水平：_________
5.结果：_____________________________________
_____________________________________
重组DNA技术
基因
分子水平
基因重组
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
基因工程的诞生和发展
思考：
1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
2.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸
②双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
①基因是控制生物性状的独立遗传单位
②遗传信息的传递都遵循中心法则
③生物界共同一套遗传密码
问题探讨
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
在培育转基因番木瓜时，既要在体外对含有所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接”；又要将重组DNA分子导入番木瓜体内，并使其表达。
讨论：
科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
工具
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
限制性内切核酸酶
DNA连接酶
载体
一、分子手术刀—限制性内切核酸酶
1.全称和简称
全称——______________
简称——_______
2.来源
主要是从________中分离纯化出来的
3.作用（功能）
①能够识别_____DNA分子的某种_____________
②使______链中_______的__________断开
确切来说应该是催化磷酸二酯键断开
该过程“特定”体现了酶的专一性
限制性内切核酸酶
限制酶
原核生物
双链
特定核苷酸序列
每一条
特定部位
磷酸二酯键
4.作用部位
___________________________________
___________________________________
磷酸二酯键（详细：双链DNA分子的特定核苷酸序列，每一条链中特定部位的磷酸二酯键）
A
T
C
G
T
A
G
C
5’
3’
5’
3’
磷酸二酯键
限制酶只切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键
5.识别序列
大多数限制酶的识别序列由___个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由___个、___个或_______的核苷酸组成
6
4
8
其他数量
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
BamHⅠ
5’…G-G-A-T-C-C…3’
3’…C-C-T-A-G-G…5’
TaqⅠ
5’……T-C-G-A……3’
3’……A-G-C-T……5’
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的
，称为回文序列
6.切割结果
DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——________和_______
当限制酶在它识别序列的_________将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是________；
当限制酶在它识别序列的________切开时，产生的是______；
黏性末端
平末端
中轴线两侧
黏性末端
中轴线处
平末端
（1）实例1——EcoRⅠ限制酶切割
EcoRⅠ识别序列为GAATTC
EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键
黏性末端
黏性末端
形成的黏性末端（从5’往3’读）为_____
一个限制酶切割一次形成___个黏性末端
同一种限制酶切割形成的黏性末端____
两个黏性末端有___个游离的磷酸基团
AATT
两
相同
2
（2）实例2——SmaⅠ限制酶切割
SmaⅠ识别序列为CCCGGG
SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键
平末端
现学现用：写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ________
EcoRⅠ________
HindⅢ________
BglⅡ
________
GATC
AATT
AGCT
GATC
思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
现学现用：
以下黏性末端是由__种限制酶作用产生的
3
思考：你从中发现什么现象了？
相同的黏性末端也可能是由不同限制酶作用形成的
现学现用：课后题拓展应用2
有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：
哪种限制酶切割B片段产生的DNA
片段能与限制酶SpeⅠ切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？
XbaⅠ
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端（可互补）
资料卡——限制酶名字的由来
用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
例如一种限制酶是从大肠杆菌（Escherichia
coli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；
如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRⅠ。
小练习：
粘质沙雷氏杆菌（Serratia
marcesens）中分离的第一种限制酶即_______
SmaⅠ
旁栏思考题：
1.根据刚才所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
2.试推测限制酶为什么不会切割自身的DNA
？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。
所以，简单来说：限制酶在原核生物中起到的作用为：
切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全
原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰
二、分子缝合针—DNA连接酶
1.功能
将________________，恢复被限制酶切开的_______
不连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
2.分类和对比
两个DNA片段连接起来
磷酸二酯键
①种类
②来源
③功能特性
④相同点
E·coli
DNA连接酶
T4
DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（连接平末端的效率相对较低）
恢复的都是磷酸二酯键
G
A
A
T
T
C
C
T
T
A
A
G
G
A
A
T
T
C
C
T
T
A
A
G
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
用同种限制酶(EcoRⅠ)切割
思考：
把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键
A
A
T
T
G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
旁栏思考：
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
旁栏思考：
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
种类
DNA聚合酶
DNA连接酶
不同点
作用实质
作用结果
模板
相同点
催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键
催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子
催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子
需要
不需要
①化学本质都是蛋白质
②都是催化形成磷酸二酯键
思考：
比较以下几种酶
种类
作用底物
作用部位
形成产物
DNA连接酶
DNA聚合酶
限制酶
解旋酶
DNA分子片段
脱氧核苷酸
DNA分子
DNA分子
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
氢键
重组DNA分子
新的DNA分子
含黏性末端或平末端的DNA片段
单链DNA
三、分子运输车——载体
1.作用
____________________
2.作为载体需具备的条件
①___________________________________________
②___________________________________________
③___________________________________________
④___________________________________________
3.常用载体种类
将外源基因送入受体细胞
有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中
能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选
对受体细胞无害
种类
用途
不同点
质粒、噬菌体
植物病毒
动物病毒
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
4.最常用的运载体——质粒
（1）天然质粒的特点
质粒是一种____的、_______的、独立于________（如酵母菌）______或______________之外，并具有_______能力的___________分子
裸露
结构简单
真核细胞
细胞核
原核细胞拟核DNA
自我复制
环状双链DNA
思考：
质粒有___个游离的磷酸基团
0
（2）基因工程使用质粒的特点
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是______________进行过_______的，这些质粒上常有____________，如____________、_____________等，便于__________________；
天然质粒的基础上
人工改造
特殊的标记基因
四环素抗性基因
氨苄青霉素抗性基因
重组DNA分子的筛选
现学现用：
选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来
1.在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应选择的限制酶为______
2.在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应选择的限制酶为______
①或②
①
酶③也会切割酶②识别的序列，因此不能选择酶③
思考·讨论
构建重组DNA分子(EcoRⅠ切割)
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
思考：
1.插入载体的这段DNA片段能称得上一个基因吗？
2.从以上操作可推知，在切割含“目的片段”的DNA分子时，需用限制酶切割___次此DNA分子，产生____个末端,出现____个游离的磷酸基团
3.目的片段翻转过来，可以连接吗？____
4.目的片段可以自身环化吗？_____
4.切割目的基因和载体时，需要用____限制酶,目的是_________________
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上
2
4
4
同种
产生相同的黏性末端
一定是同一种限制酶吗？
可以
可以
拓展练习：
下列操作中选用哪种限制酶切割构建重组DNA分子？
（注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因）
HindⅢ和PstⅠ
防止目的基因的自身环化
防止目的基因反向连接到载体
思考：课后题拓展应用2（2）
不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶；同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大；
例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断，这是可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因
思考：
基因工程中的载体和载体蛋白是一回事吗？
基因工程种的载体
载体蛋白
化学本质
作用
DNA分子
蛋白质
将外源基因送入受体细胞
运载要进出细胞的特定物质
限制酶
DNA连接酶
基因工程基本工具
来源
识别序列
作用及作用部位
切割结果
功能
分类
载体
功能
分类
作用部位
需具备的条件(共11张PPT)
问题探讨
DNA存在于细胞内部，如果要在体外对DNA进行操作，第一步应该怎么做？
将DNA提取出来，并进行鉴定
一、实验原理
1.提取思路
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在的差异，选用适当的物理或化学方法对他们进行提取
2.提取原理
①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，
利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质；
②DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，
它能溶于2mol/L的NaCl溶液。
3.鉴定原理
在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
思考：
1.如何描述该变化曲线？
2.若DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最高，如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？
在NaCl溶液浓度低于0.14
mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14
mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度高于0.14
mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐升高
先用2mol/L
的NaCl溶液溶解DNA，再加入蒸馏水，使其溶液浓度从2mol/L下降到0.14
mol/L，使DNA在盐溶液中析出
二、材料用具
1.选材
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等
注意，不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
2.试剂
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L
的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
拓展了解——研磨液各成分的作用
1.SDS
使蛋白质变性与DNA分离
2.EDTA
一种DNA酶的抑制剂，可防止细胞破碎后DNA酶降解DNA
3.Tris-HCl
提供缓冲体系，DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态
三、方法步骤
1.取材、研磨
2.过滤或离心取上清液
3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定
1.取材、研磨
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL
研磨液，充分研磨
①研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
②研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
③有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
④研磨不宜太用力
2.过滤或离心取上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
②低温放置几分钟的作用
可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂；
3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
①搅拌时应轻缓、并沿一个方向
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
②酒精预冷的作用
同“低温放置的作用”
4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
实验组
对照组
水浴加热
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关
思考：
1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？
2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？
3.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？
将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液
利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开
进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质
