2.2 动物细胞工程 动物细胞融合技术与单克隆抗体 课件34张--2020-2021学年人教版（2019）高中生物选择性必修三

问题探讨
想要制备大量特异性抗体，浆细胞能产生特异性抗体但无法增殖且寿命有限，而癌细胞能大量增殖，但是没有产生抗体的能力。
讨论：
有没有一种方法能获得兼具两者功能的细胞？
诱导动物细胞融合
一、动物细胞融合技术概述
1.概念
使_____或_____动物细胞结合形成_____细胞的技术
2.结果
形成的________具有_________________________
3.原理
____________________
4.意义
___________________________________
5.诱导融合的常用方法
________、________和_____________
两个
多个
一个
杂交细胞
原来两个或多个细胞的遗传信息
细胞膜具有一定的流动性
PEG融合法
电融合法
灭活病毒诱导法
*其中灭活病毒诱导法是动物细胞融合特有的诱导融合方法
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
相关信息了解
思考1.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？
思考2.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？
用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
6.融合实质及完成的标志
____________________
7.应用
①细胞融合技术已经成为研究________、________、_____和______________等的重要手段
②利用动物细胞融合技术发展起来的__________，为_____________开辟了新途径
细胞核的融合
细胞遗传
细胞免疫
肿瘤
培育生物新品种
杂交瘤技术
制造单克隆抗体
二、动物细胞融合和植物体细胞杂交比较
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}
植物体细胞杂交
动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性
植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；
聚乙二醇（PEG）融合法、
高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法
电融合法
灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
三、单克隆抗体的制备
1.研究背景
（1）早期获得抗体的方法
____________________________________________
____________________________________________
（2）上述抗体的缺点
____________________________________________
（3）大量制备单一抗体的思路和需解决的问题
向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体
产量低、纯度低、特异性差
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
单一B淋巴细胞
细胞群
选择
克隆
产生
大量纯度高特异性强的抗体
一个B淋巴细胞不可能无限增殖
思考：
1.B细胞的特点（优点和局限性）*？
2.哪种细胞可以无限增殖？
3.癌细胞的特点（优点和局限性）*？
4.有什么办法能得到既能迅速大量增殖又能产生大量特定抗体的细胞？
能产生单一的特异性抗体，但不能无限增殖
癌细胞
能在体外大量增殖，但不能产生抗体
动物细胞融合
（4）单克隆抗体制备思路
一种B淋巴细胞（只产生一种特定抗体）
能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞
动物细胞融合
杂交瘤细胞
动物细胞培养
大量的特定抗体
米尔斯坦
科勒
由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖
2.过程
注射特定的抗原
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
①未融合的细胞
②多种杂交细胞（包括B-B细胞、瘤-瘤细胞、杂交瘤细胞）
动物细胞融合
①未融合的细胞
②多种杂交细胞
杂交瘤细胞
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（能产生特定抗体的杂交瘤细胞）
用特定的选择培养基
第一次筛选
克隆化培养、抗体检测
第二次筛选（可进行多次）
注射到小鼠腹腔内
体外培养
获取单克隆抗体
从小鼠腹水中
从细胞培养液中
动物细胞培养
①未融合的细胞②多种杂交细胞
杂交瘤细胞
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（能产生特定抗体的杂交瘤细胞）
用特定的选择培养基
第一次筛选
克隆化培养、抗体检测
第二次筛选（可进行多次）
注射到小鼠腹腔内
体外培养
获取单克隆抗体
从小鼠腹水中
从细胞培养液中
注射特定的抗原
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
动物细胞融合
动物细胞培养
（1）该过程中应用到的技术
__________________________
（2）原理
____________________________
（3）注射特定抗原的目的
____________________________
____________________________
____________________________
（4）诱导融合的方法
_______________________________
动物细胞特有的为______________
动物细胞融合、动物细胞培养
细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
*不是为了得到抗体！
灭活病毒诱导法
思考：
只考虑两两融合，诱导融合之后，一定会得到所需的杂交瘤细胞吗？
未融合的亲本细胞
两两融合的细胞
融合的具有同种核的细胞
融合的杂交瘤细胞
B-B细胞
瘤-瘤细胞
（5）第一次筛选的目的
__________________________
（6）如何筛选
____________________________
（7）筛选原理
____________________________
____________________________
____________________________
（8）杂交瘤细胞的特点
____________________________
筛选获得杂交瘤细胞
用特定的选择培养基进行筛选
在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
既能迅速大量繁殖，又能产生抗体
补充了解——HAT培养基的筛选原理
①细胞合成DNA有两条途径，正常细胞内两种途径都有，若全合成途径被阻断，可以通过补救合成途径合成DNA；
②骨髓瘤细胞不能合成转化酶和激酶，因此只能进行全合成途径；
③全合成途径能被氨基喋呤（A）阻断；
④次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶（T）是补救合成途径的原料；
⑤无增殖能力的细胞在培养基中存活仅5-7天，细胞的多聚体也容易死去；
将诱导融合后的细胞接种于HAT培养基后两周，则细胞生存状况及原因为：
B细胞和B-B细胞________________________________________
骨髓瘤细胞和瘤-瘤细胞__________________________________________
杂交瘤细胞_____________________________________________
死亡；能进行补救合成途径，但是无增殖能力；
死亡；两种途径均无法进行，无法合成DNA，无法增殖；
存活；能进行补救合成途径，能合成DNA，可大量增殖；
思考：
得到的杂交瘤细胞一定是所需的吗？
杂交瘤细胞并不纯，因为从脾脏获得的B淋巴细胞不纯（既有未免疫的B淋巴细胞，又有产其他抗体的B淋巴细胞，以及能产所需抗体的B淋巴细胞），因此要进行第二次筛选；
（9）第二次筛选的目的
____________________________
____________________________
（10）如何筛选
____________________________
____________________________
____________________________
（11）选择抗体检测呈___性的杂交瘤
细胞，即_______________________
（12）抗体检测原理
__________________________________
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
阳
分泌的抗体能与特定的抗原结合
抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）
补充了解——克隆化培养和抗体检测
★
有限稀释法
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
侧面模拟图
克隆化培养一段时间
取上清液进行抗体检测
补充了解——不同水平的克隆及实例
分子水平
细胞水平
个体水平
DNA复制、PCR技术
动物细胞培养
植物组织培养、动物细胞核移植
思考：单克隆抗体的制备涉及什么水平的克隆？
细胞水平
（13）如何获取大量所需杂交瘤细胞
____________________________
____________________________
（14）如何获取单克隆抗体
①体外培养
____________________________
②小鼠腹腔内培养
____________________________
（15）单克隆抗体的优点
_______________________________
_______________________________
在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖
从细胞培养液中获取
从小鼠腹水中获取
能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备
老课本：特异性强、灵敏度高、并可大量制备
现学现用：
请用箭头把以下部分步骤的字母按正确顺序连接起来
B
A
E
C
G
D
H
F
思考：
试比较两次筛选的原因、方法和结果
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}
第一次筛选
第二次筛选
原因
方法
结果
诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
用特定的选择培养基进行筛选
用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
筛选获得杂交瘤细胞
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
四、单克隆抗体的应用
讨论1：
ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞
讨论2：
除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗
讨论3：
单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；
生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；
②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点
1.用作诊断试剂
（1）原理
____________________________________________
____________________________________________
（2）具体应用及部分实例
①多种疾病的诊断
实例：利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病
②病原体的鉴定
实例：乙肝病毒表面抗原定量检测试剂盒
③其他类型诊断
实例：早早孕诊断试剂盒
单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合
2.运载药物
（1）具体应用实例
与药物结合，制成__________________，杀伤癌细胞；
ADC通常由_____、_____和_____三部分组成；
（2）原理
通过将药物与_____________________的单克隆抗体结合，实现对肿瘤细胞的__________；
发挥杀伤作用的为____________________________；
单克隆抗体作用为___________；
（3）优点
________________________________________
抗体-药物偶联物（ADC）
抗体
接头
药物
能特异性识别肿瘤细胞抗原
选择性杀伤
放射性同位素、化学药物或细胞毒素
靶向运输作用
靶点清楚、毒副作用小（不会对健康细胞造成伤害）
3.治疗疾病
单克隆抗体单独使用，也可直接用于治疗疾病；
实例：利妥昔单抗（美罗华）是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与CD20分子结合引起的直接效应，抑制细胞生长，改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞。
概述
应用
动物细胞融合
技术
过程
结果
意义
原理
融合方法
原理
应用
单克隆抗体的制备
免疫处理
第一次筛选
诱导融合
第二次筛选
大规模培养
诊断试剂
运载药物
治疗疾病
克隆化培养
抗体检测
体外培养
小鼠腹腔