(共28张PPT)
分离以尿素为氮源的微生物
实验2
从自然界中分离微生物
自然环境中微生物的种类和数量要受到所处环境中有机物、氧、温度、水分、pH值、光线等各种因素的影响。
土壤中的微生物分布的数量：按种类递减，细菌(108个/g)>放线菌(107个/g)>霉菌(106个/g)>酵母菌(105个/g)>藻类(104个/g)>原生动物(103个/g)。
土壤中的大量微生物已成为分离各种抗生素、生理活性物质、酶和氨基酸产生菌的主要来源。
目前全世界能分离培养的微生物还不到其总数的1%。
从土壤中采集微生物
土壤有机质含量和通气状况 有机质丰富的土壤如耕土,菜园土,近郊土壤,通气保水性能好,适合细菌,放线菌生长繁殖;森林土植被多,枯叶多,有机质丰富,但阴暗潮湿,适合霉菌,酵母生长繁殖;沙土,无植被的山坡土等有机质含量少的,微生物含量少。
土层的纵剖面 采土样最好的土层是5—25cm。由于阳光照射，1-5cm的表层土的蒸发量较大、又由于紫外线具有杀菌作用，所以该土层的微生物数量较少；25cm以下的土层因土质紧密,空气、营养、水分缺乏,含菌量逐步减少。
土壤采样方法:采土样地点选好后,用小铲子去除5cm表土,取离地面5-15cm处的土样10-25克,盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧,并标明时间,地点和环境等情况,以备查考。
分离纯化
为了获得某一特定的微生物菌种，必须进行微生物的分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分离出来。
好氧微生物的分离纯化
1、常规的分离方法：划线分离法、稀释涂布法
变色圈法：在平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。产生有机酸或胺等碱性物质的微生物，通常采用pH值指示剂可检测出来。
2、平皿反应快速检出法：选用特异的检出方法和筛选方案，可显著提高菌株分离纯化的效率。
原理：根据微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计特殊的分离培养基,通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应如透明圈、变色圈、抑菌圈等进行分离。
细菌
尿素 NH3
中性 碱性
酚红颜色： 黄色 紫红色
变色范围是pH6.4-8.2
细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中的尿素分解，产生的氨使培养基变碱，于是酚红由黄变红。随着培养时间的延长，红色区域的面积越来越大。
（一）制备培养基：
全培养基、 尿素培养基
（二）制备细菌悬液
制备成10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀释液
实验组
对照组
倒平板
需要倒3个LB平板，9个尿素平板
LB(对照) 尿素
10-2
10-3
10-4
每个稀释度 1个LB对照平板 3个尿素平板(平行重复组)
（四）实验结果1
全培养基
尿素培养基
10-2
10-3
10-4
10-5
（四）实验结果2
全培养基
尿素培养基
10-2
10-3
10-4
恒温37℃培养
LB培养基上10-2、10-3、10-4 、10-5稀释度土样涂布结果
尿素培养基上10-2、10-3、10-4 、10-5稀释度土样涂布结果
配制菌悬液
1个99ml无菌水 2个9ml无菌水
得10-2, 10-3, 10-4的菌悬液
1g土壤
稀释菌悬液 （使用1000μL）
高浓度→低浓度，换枪头
涂布分离
低浓度→高浓度，可不用换枪头
涂布分离
涂布前后三角刮刀需要灼烧吗？
微量移液器的使用
第一档
第二档
严禁超越两端极限量程
使用结束后，将刻度调回最大量程
微量移液器的使用
练习题
1、选择培养基：在微生物学中，将允许 种类的微生物生长，同时 和 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
阻止
特定
抑制
2、常用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。当样品的 足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板进行计数。此外，测定微生物数量的常用方法还有 直接计数。
显微镜
稀释度
细菌
30-300
3、在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出 ，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。
平均数
4、用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中．得到以下几种统计结果，正确的是
A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、240和250，取平均值233
D
5.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生原因可能有( )
①由于土样不同 ②由于培养基污染
③由于操作失误 ④没有设置对照
A．①②③ B．②③④ C．①③④ D．①②④
A
分解纤维素的微生物的分离与鉴定
二、实验原理
土壤有“微生物的天然培养基”之称，土壤中含有大量的不同类型的微生物。可用选择培养基(利用微生物的特性,配制成适合于某种微生物生长,而限制其他微生物生长的培养基)选择一些特定的微生物进行分离培养，并能对特定的微生物类群进行数量测定。
基本原理是通过稀释使菌体细胞充分分散，单细胞得以生长发育形成菌落。
可使用稀释涂布接种细菌，并可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有某种菌的数量。
二、实验原理
选择培养基选择一些特定的微生物进行分离培养，为了得到数量较多的特定的微生物，可以进行富集（增殖）培养。培养后的分解纤维素的微生物可以用刚果红染色法进行鉴别。
刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
二、实验原理
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。在特定环境中只让 1种来自同一祖先的微生物群体生存的技术叫做纯化。(获得单菌落）
分离纯化的方法：稀释涂布平板或平板划线等
将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可用。
四、实验步骤
1、流程
制备培养基 → 灭菌 →倒平板
↓
划线
称土样→梯度稀释菌液→ 涂布
→培养→观察、计数、鉴别。
4.1.2 探究纤维素分解菌的种类
实验3 观察土壤中能水解纤维素的微生物
实验结果
1号
2号
色素斑
1号培养皿经高压灭菌后，培养一段时间：纸仍为白色且没有色斑。
2号培养皿未经高压灭菌，培养一段时间：纸上有红色、黑色色斑，如果继续培养，会发现纸张局部变薄。
实验结果(共24张PPT)
实验2 分离以尿素为氮
源的微生物
分离微生物的方法:
平板划线分离法
稀释平板分离法
选择培养基培养法
平板划线分离法
稀释平板分离法
选择培养基培养法
尿素又称脲,是蛋白质的降解产物,哺乳动物的尿液中含有,植物不能直接吸收尿素,因此,大量尿素的存在对环境造成污染.有些细菌可产生脲酶,以尿素为氮源,脲酶可将尿素分解为氨,被植物吸收.
一、实验原理
用选择培养基可分离出以尿素为氮源的微生物，这些微生物可产生脲酶，脲酶可将尿素分解为能被植物吸收的氨，因此这类微生物具有一定的生态学价值。稀释涂布平板法统计土壤样品中含有的这种微生物的数目
细菌
尿素 NH3
中性 碱性
酚红颜色： 黄色 紫红色
二、实验目的:
使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌(有脲酶)
通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基pH的变化(脲酶催化的化学反应)
统计被检测的土壤中含有的以尿素为氮源的微生物的数量
三、实验中涉及到的一些问题：
（一）哪些土壤中含有这种以尿素为氮源的微生物多？（选材的问题）
（二）此实验用到的选择培养基必需含有哪些物质？
（三）可用什么指标认定不同土壤中选择出的微生物对尿素分解能力的高低？
（四）统计微生物的数量可用哪些方法？
没硬化，腐殖质丰富的土壤
碳源、尿素、无机盐、水、酚红
培养基红色的深浅
稀释涂布平板法，显微镜直接记数法
三、实验中涉及到的一些问题：
（五）用稀释涂布平板法计数时，菌落数在30-300（20以内）计数。
重复性原则
对照原则
（排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验的可信度）
做一系列浓度梯度实验，探究合适的稀释度
（六）实验设计要遵循的原则：
两位同学分别用稀释涂布法测定同一土壤样品中的细菌数．在对应稀释倍数为１０３的培养基中，得到以下两种统计结果．
第一个同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为２３０．
第二个同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为２１、２１２和２５６。该同学以这三个平板上菌落数的平均值作为统计结果。
你认为这两位的同学需要改进吗？如果需要，如何改进？
第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值 。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性
两位同学分别用稀释涂布法测定同一土壤样品中的细菌数．Ａ同学筛选出大约１５０个菌落，但是，Ｂ同学在同样稀释度下只获得５０个菌落。
Ｂ同学认为Ａ的结果有问题。他认为Ａ的培养基可能被杂菌污染了，或在培养基中混入了其他含氮物质，导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。
你能帮Ａ解决这个问题吗？
将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染
四、实验用品和材料：
五、操作步骤：
２、倒平板：
３、制备一定浓度梯度的细菌悬液：
１g土壤＋９９ml无菌水，振荡，为１０２稀释液，依次制备１０３、１０４、１０５的土壤稀释液。
４、稀释涂布分离法分离细菌
１、制备无菌的ＬＢ固体培养基和尿素固体培养基
５、培养观察（倒置，３７度）
倒３个ＬＢ培养基，９个尿素固体培养基
（无菌，0.1ml，玻璃刮刀）
配制培养基
尿素培养基（1L）
葡萄糖 10g
NaCl 4.8g
K2HPO4 4.8g
琼脂 20g
酚红 0.01g
尿素 80g
LB培养基（1L）
蛋白胨： 10g
酵母粉： 5g
NaCl： 10g
琼脂： 20g
对照组
选择培养基
实验组
过滤灭菌后的尿素
倒平板
需要倒3个LB平板，9个尿素平板
LB(对照) 尿素
10-2
10-3
10-4
每个稀释度 1个LB对照平板 3个尿素平板(平行重复组)
配制菌悬液
1个99ml无菌水 2个9ml无菌水
得102, 103, 104的菌悬液
1g土壤
接种
取100ul菌悬液
涂布分离
涂布分离
涂布前后三角刮刀需要灼烧吗？
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。
37℃倒置培养
按浓度捆成一摞
恒温37℃培养
五、操作步骤：（学生做）
２、倒平板：倒２个ＬＢ培养基，２个尿素固体培养基
３、制备一定浓度梯度的细菌悬液：
１g土壤＋９９ml无菌水，振荡，为１０２稀释液，依次制备１０３、１０４（０.５＋４.５ml无菌水）的土壤稀释液。
４、稀释涂布分离法分离细菌
１、制备无菌的ＬＢ固体培养基和尿素固体培养基
５、培养观察（倒置，３７度）
10-4 、 10-3,、 10-2
