6.2
DNA片段的扩增——PRC技术
★课题目标
（一）知识与技能
1、了解PCR技术的基本操作
2、理解PCR的原理
3、讨论PCR的应用
（二）过程与方法
在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件
（三）情感、态度与价值观
通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神
★课题重点
PCR的原理和PCR的基本操作
★课题难点
PCR的原理
★教学方法
启发式教学
★教学工具
多媒体课件
★教学过程
（一）引入新课
在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。
（二）进行新课
1．基础知识
PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：
1．1细胞内DNA复制条件分析：
条件
组分
作用
模板
DNA的两条单链
提供复制的模板
原料
四种脱氧核苷酸
合成DNA子链的原料
酶
解旋酶DNA聚合酶
打开DNA双螺旋催化合成DNA子链
能量
ATP
为解螺旋和合成子链供能
引物
RNA
为DNA聚合酶提供合成的3’端起点
1．2细胞内DNA复制过程
（1）DNA的反向平行结构：（结合教材图5－6）
核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）
由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。
DNA双螺旋结构的反向平行结构：
（2）DNA的复制过程:
解
旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。
引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。
DNA聚合酶结合：
子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。
后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）
子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。
感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。
［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？
DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。
［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。
1．3DNA分子复制的人工控制
解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。
恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。
复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。
反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。
［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）
4．PCR的反应过程
变性：在95℃时DNA解旋
复性：在50℃时引物与DNA单链结合
延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）
2．实验操作
2．1
PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水
2．2
实验操作步骤
2．3
按照PCR反应体系配方配制反应液；
（2）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；
（3）将微量离心管放到PCR仪中；
（4）设置PCR仪的工作参数。
（5）DNA在PCR仪中大量扩增。
2．4
水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。
3．实验注意事项
3．1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。
3．2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。
3．3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。
3．4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。
4．结果分析与评价
4．1反应液稀释：取2 LPCR反应液，添加98 L蒸馏水；2．分光光度计调零：将100 L蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。
4．2将100 L反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。
4．3计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数
（三）课堂总结、点评
（四）实例探究
例1
在（
）的温度范围内，DNA的双螺旋结构解开
A.
10－20℃
B.
80－100℃
C.
20－30℃
D.
40－60℃
解析：蛋白质大多不能忍受60－80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。
答案：B
例2
关于DNA的复制，下列叙述正确的是（
）
A.
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5’端延伸DNA链
B.
DNA复制不需要引物
C.
引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D.
DNA的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸
解析：由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3’端即复制方向由3’端向5’端延伸；由于DNA分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是从子链5’端向3’端延伸。
答案：C
☆综合应用
例3
下列有关PCR描述，不正确的是（
）
A.
是一种酶促反应
B.
引物决定了扩增的特异性
C.
扩增产量按y＝（1＋X）n
D.
扩增对象是氨基酸序列
E.
扩增对象是DNA序列
解析：PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它以极少量的DNA为模板，以四种脱氧核苷酸为原理，在引物的作用下使DNA聚合酶从引物的3’端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份的DNA拷贝，其扩增产量为y＝（1＋X）n，y代表DNA片段扩增后的拷贝数，x表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数，因此答案选D。
答案：D
★课余作业
1、PCR与生物体DNA复制有何区别？
2、如果在案件侦破过程中，只收集到一根毛发，但它所含的遗传信息太少，该怎么办呢？
★教学体会
教师在教学过程中，可以鲜引导学生回忆必修2的有关DNA复制的知识，在此基础上，学生可加深对于PCR原理的认识。对于PCR反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的描绘了参与PCR的各种组成成分；每一轮反应的三个基本步骤—变性、复性、延伸；每一步骤的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解答。
延伸
复性
变性
多聚酶链式反应扩增DNA片段
PCR原理
DNA的复制需要酶、原料、能量、引物
DNA的变性和复性受温度影响
PCR过程
变性
复性
延伸
操作步骤
配制PCR反应体系
移入离心管
放入PCR
设置工作参数
DNA扩增
测定含量
稀释
调零
测定并读数
计算第六章
蛋白质和DNA技术
第二节
DNA片段的扩增——PCR技术
1．关于DNA复制，下列叙述正确的是（ ）
A．DNA复制时，以RNA单链为模板
B.
DNA复制不需要引物
C．引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D.
DNA数量呈4n指数增长
2．下列有关PCR反应的叙述，正确的是（ ）
A．PCR反应所需要的引物是RNA
B．PCR反应所需要的材料是核糖核苷酸
C．PCR反应所需要的酶在60
℃会变性
D．PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行
3．有关PCR技术，下列叙述不正确的是（ ）
A．用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸
B．在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似
C.
PCR反应只需一定的缓冲溶液和DNA模板以及四种脱氧核苷酸
D.
PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为高温变性、低温复性、中温延伸
4．利用PCR技术扩增某DNA片段得到下图所示产物，则该产物至少经过几次循环才能产生？（ ）
A．1次
B．2次
C．3次
D．4次
5．PCR操作中，从第二轮循环开始扩增的DNA片段（ ）
A．长度固定
B．一端固定
C．都不固定
D．不能确定
6．多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95
℃下使模板DNA变性、解链→55
℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72
℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是（ ）
A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合依靠互补配对原则完成
C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D．PCR与细胞内DNA复制相比，所需要酶的最适温度较高
7．使用PCR仪的具体实验操作顺序应为（ ）
①设计好PCR仪的循环程序 ②按配方准备好各组分 ③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 ④进行PCR反应 ⑤离心使反应液集中在离心管底部
A．②③⑤④①
B．①⑤③④②
C．②③⑤①④
D．④②⑤③①
8．退火温度是影响PCR特异性的较重要的因素。变性后温度快速冷却至40～60
℃，可使引物和模板发生结合。PCR的结果可不考虑原来解旋开的两个DNA模板链的重新结合，原因不包括（ ）
A．由于模板DNA比引物复杂得多
B．引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞
C．加入引物的量足够多而模板链数量少
D．模板链经加热解旋已经变性，不可能再次结合
9．DNA检测技术可应用于亲子鉴定、遗传病检测等领域。DNA检测离不开对样品DNA的PCR扩增。不同样品DNA的扩增过程或条件不同的是（ ）
A．引物
B．DNA聚合酶
C．四种脱氧核苷酸
D．预变性的温度
10．在PCR实验操作中，下列说法不正确的是（ ）
A．在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个吸头
B．离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢
C．用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合
D．离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效果
11．下列关于PCR技术的应用，错误的一项是（ ）
A．古生物学研究、刑侦破案、DNA序列分析
B．诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学研究
C.
DNA序列分析、基因克隆、刑侦破案
D．诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列分析
12．多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列有关PCR技术的基本原理及应用问题。
（1）PCR利用DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到______________，它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫________。
（2）PCR的每次循环可以分为____________________________________________
________三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有________个这样的DNA片段。
（3）请用简图表示出一个DNA片段PCR反应中第二轮的产物________。
（4）简述PCR技术的主要应用。__________________________________________
________________________________________________________________________。
13．PCR技术是把某一DNA片段在体外酶的作用下，合成许多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异地扩增任何目的基因或DNA分子片段；电泳技术则是在外电场作用下，利用分子携带的净电荷不同，把待测分子的混合物放在一定的介质（如琼脂糖凝胶）中进行分离和分析的实验技术，利用它可分离氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等物质和作亲子鉴定。下图是电泳装置及相应电泳结果。
（1）PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是________。
（2）图3是把含有21个氨基酸的多肽进行水解得到的氨基酸混合物进行电泳的结果，故可推知该多肽由________种氨基酸构成。
（3）电泳和叶绿体色素分离采用的纸层析法比较，后者使用的介质是________；电泳过程中，分子的迁移速率除与本身所带净电荷的多少有关外，你认为还受什么因素影响？__________________________________________（至少列出两种）。
（4）图4通过提取某小孩和其母以及待测定的四位男性的DNA，分别用酶处理后，生成若干DNA片段，并进行扩增得到的混合物，然后进行电泳得到的一组DNA指纹图谱。请分析，在F1～F4中谁最可能是该小孩真正的生物学父亲？________。为什么？
________________________________________________________________________。
14．请回答下列问题。
（1）利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。
①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为______。
②在第______轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
（2）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。
第1组：________________________________________________________________；
②
第2组：________________________________________________________________。
（3）PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为________________________________。
参考答案
1．解析：DNA复制时，以DNA单链为模板；需要RNA引物；DNA数量以2n形式增长。
答案：C
2．解析：PCR反应需要的引物是DNA，反应所需要的材料是脱氧核苷酸，PCR所需要的酶是耐高温的，在60
℃不会变性。
答案：D
3．解析：PCR反应中需要的条件有模板（DNA分子）、原料（4种脱氧核苷酸）、酶（DNA聚合酶）、引物（一段DNA）和一定的缓冲液等。
答案：C
4．解析：PCR技术中，第一次循环产生两个DNA分子，每个DNA分子只有一条链具有引物。第二次循环产生四个DNA分子，其中两个DNA分子只有一条链具有引物，另两个DNA分子两条链都具有引物。
答案：B
5．解析：PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限制在两个引物链之间，是需要扩增的特定片段。进入第二轮循环后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合，引物在与新链结合时，由于新链模板的一端序列是固定的，这就等于这次延伸的子链片段被固定了终点，保证了新片段的起点和终点都限定于引物扩增序列以内，形成长短一致的“短产物片段”。
答案：A
6．解析：变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现；复性过程中引物与DNA模板链的结合依靠互补配对原则完成；延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种脱氧核糖核苷酸；PCR与细胞内DNA复制相比，所需要酶的最适温度较高。
答案：C
7．解析：使用PCR仪进行DNA扩增前，首先按照PCR体系配方各组分，依次将各组分加入微量离心管离心，使反应液集中于试管底部，然后再设计好PCR仪的循环程序进行PCR反应。
答案：C
8．解析：DNA在80～100
℃温度下变性，但温度降低后又会复性。
答案：D
9．解析：不同的样品DNA有不同的核苷酸序列，由于引物能与模板DNA（样品DNA）按照碱基互补配对原则结合，因此不同样品DNA所需的引物有不同的核苷酸序列。
答案：A
10．解析：在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸头必须更换，确保实验的准确性；离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢；离心10
s
的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效果。
答案：A
11．解析：PCR技术能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学研究、基因克隆和DNA序列分析等各方面，而不能用于合成核苷酸。
答案：D
12．解析：（1）因PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，所以用于催化DNA复制过程的DNA聚合酶要具有耐高温的特性。在高温环境中培养微生物，只有耐高温的微生物才能生存，其他微生物因高温下酶变性而死亡。用这样的选择培养基可将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来。（2）DNA复制两条链均作为模板，进行半保留复制，所以复制5次后得到的子代DNA分子数为25＝32个。（3）新合成的DNA链带有引物，而最初的模板DNA的两条链不带有引物。（4）PCR技术可以对DNA分子进行扩增，所以可用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学研究、基因克隆和DNA序列测定等方面。
答案：（1）耐高温的DNA聚合酶 选择培养基 （2）高温变性、低温复性和中温延伸 32
（3）
（4）遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学研究、基因克隆和DNA序列测定等
13．解析：本题主要考查电泳的原理及其应用。（1）PCR是将DNA片段在酶的作用下，体外合成许多相同的片段，原理是DNA复制。（2）某氨基酸的混合物经电泳后出现分离，共有6个区域，表明此多肽由6种氨基酸构成。（3）纸层析法分离叶绿素的过程中，色素溶解在层析液中，并随之在滤纸上扩散。电泳过程中，分子的迁移速率受到多种因素影响，如分子的大小、形状，凝胶的种类、密度，电泳的电压大小等。（4）子代DNA是由亲代DNA复制而来的，所以子代DNA与亲代DNA相同，故C与F2之间为亲子关系。
答案：（1）DNA分子复制 （2）6 （3）层析液 分子的大小和形状、凝胶的种类、电泳的电压大小 （4）F2 因为C和F2的DNA图谱完全相同
14．解析：（1）①依据图解特点，第四轮循环产物中可以得到16个DNA分子，其中只有一个不含引物A的模板链，所以含引物A的DNA片段占15/16。②从图解原DNA与引物A、B的比例关系分析，经三次复制后开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。（2）比较第1组引物的碱基顺序，可以发现引物Ⅰ与引物Ⅱ的碱基能发生互补配对，形成局部双链结构而失效；而第2组引物中，引物Ⅰ′折叠后会发生碱基互补配对而导致失效。（3）在PCR反应体系中，引物首先与模板DNA单链互补配对形成局部双链DNA片段，然后在DNA聚合酶的作用下将单个脱氧核苷酸依次连接到引物链上。
答案：（1）①15/16 ②三
（2）①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
（3）DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上6.1
蛋白质的提取和分离
问题：斐林试剂和双缩脲试剂成份相同，为什么斐林试剂不能用来检测蛋白质？
（1）溶液浓度不同
斐林试剂中乙液为0.05g/ml的CuSO4溶液，双缩脲试剂中CuSO4溶液为0.01g/ml
（2）使用原理不同
斐林试剂是新配制的溶液，它在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红色的沉淀，可用于鉴定可溶性还原糖的存在。用斐林试剂鉴定可溶性还原糖时，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色→棕色→砖红色（沉淀）。
鉴定生物组织中是否含有蛋白质时，常用双缩脲法，使用的是双缩脲试剂，发生的是双缩脲反应。双缩脲反应实质是在碱性环境下的与双缩脲试剂发生的紫色反应。而蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，所以蛋白质都能与双缩脲试剂发生颜色反应，可以用双缩脲试剂鉴定蛋白质的存在。
（3）使用方法不同
斐林试剂使用时，先反溶液和溶液混合（将滴溶液滴入溶液中），而后立即使用,需要加热。
双缩脲试剂使用时，先加入溶液（2mL），振荡摇匀，造成碱性的反应环境，然后再加入3~4滴溶液，振荡摇匀后观察现象。
（4）颜色反应不同
斐林试剂与还原糖混合是产生砖红色沉淀，双缩脲试剂与蛋白质反应产生紫色反应。
一、植物组织蛋白质提取方法
1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清液，样品制备完成。
蛋白质提取液：300ml
1、1Mtris-HCl（PH8）
45ml
2、甘油（Glycerol）75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！
二、植物组织蛋白质提取方法
氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨叶片
2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！
三、植物材料：水稻苗，叶鞘，根
1、200毫克样品置于冰上磨碎
2、加lysis
buffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清
3、重复离心5min
lysis
buffer：urea
np-40
ampholine
2-me
pvp-40
四、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5
ml
10%
三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000
r/min离心15
min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10
mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10
mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20μl（可调）
UKS液[9.5
M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2%
Ampholine
(Amersham
Pharmacia
Biotech
Inc，pH3.5-10)，6%
Triton
X-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度
（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000
r/min离心15
min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存
五、植物根中蛋白质的抽取
(1)
sample,
液氮研磨
(2)
装1.5
ml
centrifuge
用tube
(3)
加
1M
KH2PO4
K2HPO4
700
ul
(4)
12000
rpm,
4度,
10-15minite
(5)
取上层液，蛋白质就在里面学业达标测评(十五)
一、选择题
1．RNA引物的合成所需的酶是( )
A．DNA解旋酶
B．DNA聚合酶
C．RNA聚合酶
D．RNA解旋酶
【解析】 细胞内DNA复制时的RNA引物是由RNA聚合酶催化形成的。
【答案】 C
2．PCR过程与细胞内的DNA复制相比，主要有两点不同，它们是( )
①PCR过程需要的引物是人工合成的DNA单链
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中DNA解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
④PCR过程不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A．①②
B．①③
C．③④
D．②③
【解析】 PCR过程与细胞内的DNA复制相比主要有两点不同：①是引物不同，PCR过程以DNA为引物，细胞内DNA复制时以RNA为引物。②是解旋的方法不同，PCR过程通过热变性解旋，DNA复制依靠解旋酶解旋。
【答案】 B
3．PCR技术利用了DNA的________原理，来控制DNA的解聚与结合( )
A．特异性
B．稳定性
C．热变性
D．多样性
【解析】 在PCR中，DNA的解聚与结合是通过热变性来完成的。
【答案】 C
4．PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，下列关于它调控不同温度的目的叙述错误的是( )
A．95
℃，使DNA分子变性，解开螺旋
B．55
℃，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性
C．72
℃，使DNA分子开始复制，延伸
D．72
℃，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性
【解析】 72
℃时，DNA分子在DNA聚合酶的作用下开始复制、延伸。
【答案】 D
5．DNA在________nm的紫外线波段存在一强烈的吸收峰，其峰值的大小与DNA含量有关( )
A．220
B．240
C．260
D．280
【解析】 DNA对紫外线的吸收峰值在260
nm处。
【答案】 C
6．下图中PCR第二轮产物a、b、c、d分别是以PCR第一轮产物的哪一条单链DNA为模板复制产生的( )
A．②①③④
B．①③④②
C．①②④③
D．①②③④
【解析】 以①链为模板复制而来的DNA应只含有引物Ⅰ(a)；以④链为模板复制而来的只有引物Ⅱ(d)；b、c是以②、③为模板复制而来的。
【答案】 D
7．在PCR扩增DNA的实验中，根据设计，一分子DNA经30次循环后，应得到约230个DNA分子，但结果只有约210个DNA分子。出现该现象的原因可能是( )
①循环次数不够 ②TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制 ③引物不能与亲链结合 ④系统设计欠妥
A．①②③
B．②③④
C．①③④
D．①②③④
【解析】 该现象属于在PCR扩增中假阴性现象。其原因有：(1)TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制导致催化效率降低，得到的产物比预期的少；(2)引物设计不合理，可能不能与模板DNA结合，导致无法进行扩增；(3)提取的模板数量或质量不过关，可能不能起模板作用，也无法进行扩增；(4)PCR系统设置不妥，达不到预期的效果；(5)循环次数过少，产物的量比预期的少。
【答案】 D
二、非选择题
8．PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用这种技术能快速而特异的扩增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人类基因组计划”的研究中常用到这种技术。请结合有关知识，回答有关此技术的一些问题：
(1)PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是____________。
(2)在实验条件下，DNA分子进行扩增，除了所要扩增的DNA片段外，还需要________、________和________等条件。
(3)某DNA片段有160个碱基，其中有腺嘌呤35个，若让该DNA分子扩增三次(即复制三次)至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是________和________个。
【解析】(1)DNA分子具有双螺旋结构，扩增时DNA分子双链之间的氢键断裂，两条链彼此分开，各自吸收细胞内的脱氧核苷酸，按照碱基互补配对原则合成一条新链，然后新旧链联系起来，各自形成一个完整的DNA分子。
(2)PCR反应的条件：①稳定的缓冲液环境，②DNA模板，③分别与模板DNA两条模板链相结合的两种引物，④A、T、G、C四种脱氧核苷酸。⑤耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶。⑥能严格控制温度变化的温控设备。
(3)在DNA片段中，有腺嘌呤35个，可求出鸟嘌呤为＝45个，DNA分子扩增三次需要腺嘌呤脱氧核苷酸35×(23－1)＝245个，鸟嘌呤脱氧核苷酸45×(23－1)＝315个。
【答案】 (1)DNA分子具有双螺旋结构和DNA分子中碱基的互补配对
(2)四种脱氧核苷酸 引物 DNA聚合酶
(3)245 315对高中生物课本中PCR技术的几点思考
一、为何不需要解旋酶？
DNA解旋酶能降低DNA双链解成单链的活化能，在解旋酶的催化作用下，由ATP提供能量,在生物体内的温和条件下就能使DNA的双链解成单链。在没有酶的催化作用下，就必须由外界提供更多的能量才能使DNA分子活化，当在体外加热到90oC—95
oC，DNA分子就由常态转化为活跃状态，双链则解成单链。所以PCR技术扩增目的基因不需要解旋酶。
二、为什么加入的原料是dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）,而不是四种脱氧核苷酸？
同学们在学习DNA复制的时候，都掌握了DNA的复制需要四种脱氧核糖核苷酸作为原料，而PCR技术扩增目的基因需要的原料却是dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）。同学们都有这样的疑问：同样是DNA的复制二者所需要的原料为何会不同呢？事实上在DNA复制时直接参与合成DNA的是四种脱氧核苷酸三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），在
DNA聚合酶催化作用下，引物或者已合成的DNA链的3’—羟基对进入的脱氧核苷酸三磷酸α—磷原子发生亲核攻击，从而形成3’，5’—磷酸二酯键并脱下焦磷酸（PPi）。形成磷酸二酯键所需要的能量来自α—与β—磷酸基之间高能磷酸键的裂解。（摘于沈同、一镜岩主编的第二版《生物化学》下册P328）。而在生物体内脱氧核苷酸在磷酸激酶的催化下接受
ATP提供的磷酸基，逐步转化为脱氧核苷酸二磷酸、脱氧核苷酸三磷酸后再参与DNA的合成。所以二者并不矛盾，用dNTP作原料在体外利用PCR技术扩增目基因简化了操作过程。
三、为什么没有加入ATP？
DNA的体内复制需要ATP作为能量物质，而体外利用PCR扩增目的基因为何没加入ATP呢？因为体内DNA的复制过程中，解旋酶将DNA双链解成单链、脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成需要ATP提供能量。而体外DNA的扩增不需要解旋酶的催化，是通过提高温度使双链解成单链，这一步不需要ATP提供能量；由问题二可知形成磷酸二酯键所需要的能量来自α—与β—磷酸基之间高能磷酸键的裂解（在体内是脱氧核苷酸在磷酸激酶的催化下接受
ATP提供的磷酸基转化为脱氧核苷酸三磷酸时，将ATP内高能磷酸键的能量转移到脱氧核苷酸三磷酸分子内）。所以体外PCR扩增目的基因不需加入ATP。
四、延伸过程是否需要DNA连接酶？
现行的一些相应配套习题关于PCR扩增目的基因是否需要DNA连接酶说法不一，本人查阅到体内DNA的复制是边解旋边复制，且是半不连续复制，DNA分子的两条链是反向平行的，一条链的走向为5’－3’，另一条链为3’—5’，而DNA聚合酶的合成方向都是5’—3’，所以在3’—5’走向的模板链上能以5’—3’方向连续合成，称为前导链，另一条5’—3’走向的模板链上随复制叉的移动，形成许多5’—3’方向的不连续片段（称为冈崎片段），在DNA连接酶的作用下连接成一条完整的DNA链，称为滞后链。PCR扩增的原理是DNA双链复制的原理，但过程却不同于体内复制过程，既不是边解旋边复制，也不是半不连续复制，是DNA双链全部解成单链后，引物与DNA单链相应序列互补结合，然后在DNA聚合酶作用下同时以5’—3’方向连续合成进行延伸，不存在前导链与滞后链的区别，自然也就不需要DNA连接酶了。
五、引物的作用是什么？
在学习过程中学生问到这样的问题：必修课本DNA复制那一节并未介绍DNA的复制需要引物，而利用PCR
扩增目的基因的时候则需要引物，那加入引物有何作用呢？实际上DNA的复制都需要引物，在体内复制时，先由RNA聚合酶在DNA的模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA3’端开始合成新的DNA链，高中阶段为便于学生理解DNA的复制就没有介绍这部分知识，体外复制当然也要加引物了。但PCR技术扩增目的基因进加入引物还有特殊的作用。PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用（见下图示）。由以上分析可知引物决定了扩增基因的特异性。
六、一定要知道目的基因的全部核苷酸序列吗？
课本谈到利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。有部分同学错误理解为PCR技术扩增目的基因要知道目的基因的全部核苷酸序列，由问题五可知PCR技术扩增的是两引物结合位点之间的序列。引物的设计直接影响到其扩增的特异性。所以只需要知道合成引物的脱氧核苷酸序列就行了，没有必要知道目的基因的全部序列。
七、PCR扩增为何要设为3段温度（90oC—95oC、55oC—60oC
、70oC—75oC），而不设为2段温度（90oC—95oC、70oC—75oC）？学生在学习这一部分知识时提出，温度降到55oC—60oC退火是为了使引物与单链DNA模板通过碱基互补配对形成氢键，在70oC—75oC下进行子链的合成延伸时仍在形成氢链，为何退火与延伸不在同一温度下进行呢？适宜温度下退火能减少非特异性结合，保证引物同目的序列有效结合。退火温度一般设定比引物的Tm(当50％的引物和互补序列表现为双链分子时的温度)低5oC—10oC。Tm值大小主要与GC含量有关，GC含量越高，Tm值越大，计算公式为Tm=4（G+C）+2（A+T）,各种引物因为长短、GC含量等不同，退火温度一般为25℃-65℃不等。而Taq酶在72℃左右才有最佳的活性。因此退火温度与延伸温度相差较大，所以要分为3段温度进行。
引物1
新引物物
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
3’
5’
5’
3’
长产物片段
5’
3’
3’
5’
靶DNA的扩增
3’
5’
5’
3’
引物2
引物1互补链
引物2互补链
5’
3’
3’
5’
长产物片段
新引物
3’
5’
5’
3’
3’
短产物片段
3’
5’
5’
第一次循环产生长产物片段段
第二次循环产生短产物片段
短片段的指数增长
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)第二节 DNA片段的扩增——PCR技术
1．理解PCR扩增DNA片段的原理。
2．尝试PCR技术的基本操作和应用。
一、细胞内的DNA复制
过程：首先在解旋酶的作用下解开DNA双链；接着在RNA聚合酶的作用下，以DNA单链为模板，合成一段RNA引物（两条DNA模板链各需一个RNA引物）；然后以RNA引物为起点，在DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则合成两条新的DNA子链。
二、DNA体外扩增——PCR技术
1．概念：DNA体外扩增技术实际上是在体外模拟细胞内的DNA复制过程，形成大量特异性的DNA片段，这个反应过程称为聚合酶链式反应，简称PCR。
2．PCR过程与细胞内的DNA复制过程的区别
（1）PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20～30个脱氧核苷酸。
（2）PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。
3．PCR技术的操作
进行PCR过程前，将PCR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg2＋等成分加入到一种特制的微量离心管中。
①高温变性：把离心管置于95
℃的高温中，DNA碱
基对之间的氢键断裂，DNA双链拆开成两条单链。
②低温复性：将离心管置于55
℃的环境中，使一对引物分别结合到两条分开的模板链上。
③中温延伸：再将离心管转置于72
℃的环境中，在DNA聚合酶的催化作用下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端一个接一个地连接上去，从而形成了两条新的子链。于是，一个DNA分子便复制成了两个。而新合成的DNA又可再度作为模板进行上述的循环，重复这三步操作，DNA片段便呈2的指数增长。该过程可在DNA扩增仪（PCR仪）内进行。
4．PCR技术的优点
快速、高效、灵活和易于操作是PCR技术的突出优点。
5．PCR扩增效果的检测
可用分光光度法进行检测。DNA在260
nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。以蒸馏水作为空白对照，在波长260
nm处测PCR产物稀释液的光吸收值（用A260
nm表示）。据测定，1
μg·mL－1的DNA在厚度为1
cm比色杯中的吸光值为0.02。以此为标准，可以计算出样品中的DNA浓度。公式如下：
DNA的浓度（μg·mL－1）＝×稀释倍数
思考：2003年SARS病毒席卷我国，随后生物科学研究所迅速研制出了SARS病毒基因诊断盒，使得能够快速诊断出非典患者，那么SARS病毒基因诊断盒所需的大量SARS基因是怎样获得的呢？
提示：采用PCR技术对SARS的基因迅速扩增产生的。
1．PCR技术与DNA的复制
PCR反应是通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR反应的实质就是DNA复制，所以有关PCR反应的题目与DNA复制的原理相同，计算方法也大体相同。例如：PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段（230）。
2．你了解生物体内DNA的复制与PCR反应的异同吗？
体内复制
PCR反应
解旋
在解旋酶的作用下，细胞提供能量，部分解开
加热至95
℃，双链全部解开，不需解旋酶
引物
一小段RNA
可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链
在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成
分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72
℃
特点
边解旋边复制，半保留复制
体外迅速扩增
Taq
DNA聚合酶
不需要
需要
循环次数
受生物体自身控制
30多次
产物
完整DNA
DNA片段
相同点
都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行
3．PCR扩增产物是什么？
可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限制在两个引物链5′端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3′端开始延伸，其5′端是固定的，3′端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5′端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3′端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内，形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯的DNA片段供分析与检测用。
细胞内RNA和蛋白质的合成是从头开始的。
4．PCR的常见问题
PCR实验很容易出现假阳性（检测非目的片段的扩增，而未检测出目的片段的扩增）或假阴性（未检测出任何片段的扩增）的结果。
出现假阴性结果的常见原因有：TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统的建立欠妥当；循环次数不够等等。当实验中出现假阴性的情况时，应首先在原来扩增的产物中再加入TaqDNA聚合酶，并增加5～10次循环。为了防止假阴性结果的出现，在选用TaqDNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时，在提取DNA模板时，应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。尽管TaqDNA聚合酶对模板纯度的要求不高，但也不允许有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低，很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况，尤其需要保证引物的3′端与靶基因互补。
PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增，因此模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要原因。此外，样品中存在靶基因的类似序列也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果，PCR操作时要注意做到：隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头等。
题型一
PCR的原理及应用
【例题1】下列有关PCR的描述不正确的是（ ）。
A．是一种酶促反应
B．引物决定了扩增的特异性
C．扩增产量为y＝（1＋x）n
D．扩增对象是氨基酸序列
解析：PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它以极少量的DNA为模板，以四种脱氧核苷酸为原料，在引物作用下使DNA聚合酶从引物的3′端连接脱氧核苷酸，短时间迅速复制上百万份的DNA拷贝，其扩增产量为y＝（1＋x）n，y代表DNA片段扩增后的拷贝数，x表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。
答案：D
【例题2】标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是（ ）。
A．95
℃、55
℃、72
℃
B．72
℃、55
℃、95
℃
C．55
℃、95
℃、72
℃
D．80
℃、55
℃、72
℃
解析：当温度在95
℃时，双链DNA解聚为单链，称之为高温变性；当温度下降到55
℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合称为低温复性；当温度上升到72
℃时，溶液中的四种脱氧核苷酸（A、T、C、G）在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。
答案：A
反思领悟：反思领悟：PCR的反应过程中每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。
题型二
PCR基本操作与产物测定
【例题3】在PCR实验操作中，下列说法不正确的是（ ）。
A．在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头
B．离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢
C．用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合
D．离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效果
解析：在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换，确保实验的准确性；离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢；离心10
s
的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效果。
答案：A
1
DNA的复制需要引物，其主要原因是（ ）。
A．可加快DNA的复制速度
B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合
C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链
D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链
解析：DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基（—OH）末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
答案：D
2
用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，是一小段（ ）。
A．DNA
B．RNA
C．DNA或RNA
D．双链DNA
解析：用于PCR的引物是一小段DNA（单链）或RNA。细胞内DNA的引物，一般为RNA。
答案：C
3
使用PCR仪的具体实验操作顺序应为（ ）。
①设计好PCR仪的循环程序 ②按配方准备好各组分 ③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 ④进行PCR反应 ⑤离心使反应液集中在离心管底部
A．②③⑤④①
B．①⑤③④②
C．②③⑤①④
D．④②⑤③①
解析：使用PCR仪进行DNA扩增前，首先按照PCR体系配方各组分，依次将各组分加入微量离心管离心，使反应液集中于试管底部，然后再设计好PCR仪的循环程序进行PCR反应。
答案：C
4
PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是（ ）。
A．反复洗涤
B．外源DNA
污染
C．高压灭菌
D．在－20
℃储存
解析：通过对PCR实验中所用仪器和试剂进行高压灭菌，可以避免外源DNA等因素的污染。
答案：C章末复习提升课(六)
蛋白质和DNA技术
聚丙烯酰胺凝胶的优点
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳方法，其优点如下：
1．聚丙烯酰胺没有或很少带有离子的侧基，因而其凝胶电泳作用比较小，不易和样品相互作用。
2．可以根据需分离物质的分子大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性能。
3．在一定浓度范围内聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。
PCR技术的基本原理
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的引物。PCR由高温变性—低温复性—中温延伸三个基本反应步骤构成：
1．高温变性：模板DNA经加热至95
℃左右，一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解旋，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮循环作准备。
2．低温复性：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55
℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
3．中温延伸：DNA模板—引物结合物在耐高温的DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为原料，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环高温变性—低温复性—中温延伸三个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又成为下次循环的模板。6.2
DNA片段的扩增——PRC技术
★课题目标（一）知识与技能
1、了解PCR技术的基本操作
2、理解PCR的原理
3、讨论PCR的应用
（二）过程与方法
在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件
（三）情感、态度与价值观
通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神
★课题重点
PCR的原理和PCR的基本操作
★课题难点
PCR的原理
★教学方法
启发式教学
★教学工具
多媒体课件
★教学过程
（一）引入新课
在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。
（二）进行新课
1．基础知识
PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：
1．1细胞内DNA复制条件分析：
条件
组分
作用
模板
DNA的两条单链
提供复制的模板
原料
四种脱氧核苷酸
合成DNA子链的原料
酶
解旋酶DNA聚合酶
打开DNA双螺旋催化合成DNA子链
能量
ATP
为解螺旋和合成子链供能
引物
RNA
为DNA聚合酶提供合成的3’端起点
1．2细胞内DNA复制过程
（1）DNA的反向平行结构：（结合教材图5－6）
核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）
由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。
DNA双螺旋结构的反向平行结构：
（2）DNA的复制过程:
解
旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。
引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。
DNA聚合酶结合：
子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。
后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）
子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。
感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。
［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？
DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。
［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。
1．3DNA分子复制的人工控制
解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。
恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。
复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。
反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。
［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）
4．PCR的反应过程
变性：在95℃时DNA解旋
复性：在50℃时引物与DNA单链结合
延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）
2．实验操作
2．1
PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水
2．2
实验操作步骤
2．3
按照PCR反应体系配方配制反应液；
（2）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；
（3）将微量离心管放到PCR仪中；
（4）设置PCR仪的工作参数。
（5）DNA在PCR仪中大量扩增。
2．4
水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。
3．实验注意事项
3．1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。
3．2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。
3．3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。
3．4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。
4．结果分析与评价
4．1反应液稀释：取2 LPCR反应液，添加98 L蒸馏水；2．分光光度计调零：将100 L蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。
4．2将100 L反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。
4．3计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数
（三）课堂总结、点评
（四）实例探究
例1
在（
）的温度范围内，DNA的双螺旋结构解开
A.
10－20℃
B.
80－100℃
C.
20－30℃
D.
40－60℃
解析：蛋白质大多不能忍受60－80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。
答案：B
例2
关于DNA的复制，下列叙述正确的是（
）
A.
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5’端延伸DNA链
B.
DNA复制不需要引物
C.
引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D.
DNA的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸
解析：由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3’端即复制方向由3’端向5’端延伸；由于DNA分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是从子链5’端向3’端延伸。
答案：C
☆综合应用
例3
下列有关PCR描述，不正确的是（
）
A.
是一种酶促反应
B.
引物决定了扩增的特异性
C.
扩增产量按y＝（1＋X）n
D.
扩增对象是氨基酸序列
E.
扩增对象是DNA序列
解析：PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它以极少量的DNA为模板，以四种脱氧核苷酸为原理，在引物的作用下使DNA聚合酶从引物的3’端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份的DNA拷贝，其扩增产量为y＝（1＋X）n，y代表DNA片段扩增后的拷贝数，x表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数，因此答案选D。
答案：D
★课余作业
1、PCR与生物体DNA复制有何区别？
2、如果在案件侦破过程中，只收集到一根毛发，但它所含的遗传信息太少，该怎么办呢？
★教学体会
教师在教学过程中，可以鲜引导学生回忆必修2的有关DNA复制的知识，在此基础上，学生可加深对于PCR原理的认识。对于PCR反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的描绘了参与PCR的各种组成成分；每一轮反应的三个基本步骤—变性、复性、延伸；每一步骤的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解答。
延伸
复性
变性
多聚酶链式反应扩增DNA片段
PCR原理
DNA的复制需要酶、原料、能量、引物
DNA的变性和复性受温度影响
PCR过程
变性
复性
延伸
操作步骤
配制PCR反应体系
移入离心管
放入PCR
设置工作参数
DNA扩增
测定含量
稀释
调零
测定并读数
计算第六章
蛋白质和DNA技术
第一节
蛋白质的提取和分离
1．下列关于蛋白质的分离方法的叙述，错误的是（ ）
A．分离主要是根据蛋白质以及蛋白质与其他物质之间的理化性质的差异进行的
B．透析技术可去除小分子化合物杂质，原理是不同分子所携带净电荷不同
C．通过控制离心速率可使分子大小、密度不同的蛋白质沉降分层，从而分离不同的蛋白质
D．不同的物质在同一电场中的泳动速度不同，因此可用电泳法分离蛋白质
2．离心技术是分离蛋白质的方法之一，在这一过程中蛋白质会分层，这一现象与蛋白质的何种性质有关？（ ）
A．酸碱性
B．所带电荷多少
C．分子大小和密度
D．种类
3．下列有关电泳现象的叙述，错误的是（ ）
A．相同蛋白质的溶液，经过同一个电场电泳后，会在支持物凝胶上形成相同的带纹
B．不同蛋白质的混合溶液，经过同一个电场电泳后，会在支持物凝胶上形成不同的带纹
C．每一种带纹可能就是一种蛋白质
D．每一种带纹一定不是一种蛋白质
4．下列关于聚丙烯酰胺凝胶电泳的叙述，错误的是（ ）
A．是最早使用的电泳技术
B．是区带电泳的一种
C．凝胶上层加浓缩胶可提高分离效果
D．分离血清蛋白质可以得到20种以上的组分
5．电泳过程中，什么样的分子迁移速度最快？（ ）
A．纤维状、大分子
B．纤维状、小分子
C．球状、大分子
D．球状、小分子
6．在血清蛋白的提取和分离过程中，所使用的染色液是（ ）
A．新制血清5
μL
B．质量浓度为0.4
g/mL的蔗糖溶液
C．质量分数为0.05%的考马斯亮蓝R250染色液
D．质量分数为0.1%的溴酚蓝指示剂
7．下面说法不正确的是（ ）
A．分离胶和浓缩胶单独存在时具有神经毒性，应避免接触皮肤
B．电泳需要支持物，常用的是聚丙烯酰胺凝胶
C．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
D．蛋白质是两性电解质，不带电荷
8．电泳法分离蛋白质时，应保证凝胶的pH（ ）
A．不断降低
B．不断升高
C．先降低后升高
D．不变且适宜
9．下面说法不正确的是（ ）
A．在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸、碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变
B．缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成
C．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
D．透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内
10．有一混合蛋白质溶液，各种蛋白质的pH分别为4.5、5.2、6.6、7.2，电泳时欲使其中三种泳向正极，缓冲液的pH应该是（ ）
A．2.0
B．5.0
C．6.0
D．7.0
11．下列关于“血清蛋白的提取和分离”的活动顺序正确的是（ ）
①染色 ②电泳 ③点样 ④脱色 ⑤制干胶板
A．①②③⑤④
B．⑤②①③④
C．④①②③⑤
D．③②①④⑤
12．各种动物血清内乳酸脱氢酶同工酶的组成是不同的。可以通过比较各种动物乳酸脱氢酶同工酶差异的大小来判断动物之间亲缘关系的远近。下列各种实验方法中，不能采用的方法是（ ）
A．测乳酸脱氢酶同工酶的氨基酸序列
B．测控制乳酸脱氢酶同工酶合成的基因碱基序列
C．用电泳法比较各种动物乳酸脱氢酶同工酶的电泳带
D．检测不同动物的乳酸脱氢酶同工酶的pH
13．下图为某些氨基酸在pH＝6时进行电泳的结果，请回答下列问题。
（1）由图示可知，pH＝6时带正电荷的氨基酸是______，带负电荷的氨基酸是______。请说明理由：___________________________________________________________________。
（2）假设谷氨酸和赖氨酸所带电荷数相同，它们到达两极的速度一样吗？______，为什么？________________________________________________________________________。
（3）若把氨基酸换成蛋白质，会出现什么现象？_____________________________
________________________________________________________________________。
14．我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。根据材料回答下列问题。
（1）实验前取新鲜血液，要在采血器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是______________________________________
________________________________________________________________________。
（2）在对样品进行处理时，主要包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析等步骤。其中透析技术的原理是__________________________________________
________________________________________________________________________。
（3）同学甲利用琼脂糖凝胶电泳技术将得到的蛋白质进行分离，在电泳过程中，影响蛋白质迁移速率的因素包括蛋白质分子的______以及分子的______、形状等。
（4）SDS凝胶电泳主要取决于蛋白质分子量的大小，与电荷无关。图一、图二分别是某同学利用同一种样品分离得到的结果，则图二中与图一中蛋白质P对应的是______。
图一 SDS凝胶电泳结果
图二 SpephadexG75,凝胶色谱分离结果
参考答案
1．解析：透析技术分离蛋白质是因为蛋白质分子大，不能透过半透膜。
答案：B
2．解析：根据蛋白质之间或蛋白质与其他分子之间在分子大小和密度上的不同，采用离心技术，使其分层而分离。
答案：C
3．解析：不同蛋白质的混合溶液，在经过同一个电场电泳后，会在支持物凝胶上形成不同的带纹，每一种带纹可能是一种蛋白质，也可能是多种蛋白质，还须洗脱确定。
答案：D
4．解析：聚丙烯酰胺凝胶电泳是最近开始使用的。
答案：A
5．解析：电泳就是利用了连续分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同。一般来说，球形分子比纤维状分子易移动，小分子比大分子易移动。
答案：D
6．解析：染色液用质量分数为0.05%的考马斯亮蓝R250染色液。
答案：C
7．解析：蛋白质是两性电解质，在一定pH条件下带有电荷。
答案：D
8．解析：pH的变化会使蛋白质的电泳速度发生改变，因此，为了使蛋白质匀速迁移，应保证凝胶的pH不变且适宜，可用缓冲溶液稳定pH。
答案：D
9．解析：透析袋一般是用硝酸纤维素（又叫玻璃纸）制成的。透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质。
答案：D
10．解析：在缓冲液的pH为7.0的溶液中，pH分别为4.5、5.2、6.6的蛋白质均带负电荷，在电泳时移向正极。
答案：D
11．解析：血清蛋白的提取和分离的过程，第一步是用微量加样器吸取样品加到电泳样品槽的胶面上，即点样。第二步是打开电泳仪的电源，进行电泳。第三步是用考马斯亮蓝R250染液进行染色。第四步是用醋酸溶液脱色。第五步是将已脱色的凝胶板浸泡后，自然干燥即获得血清蛋白的电泳谱带。
答案：D
12．解析：生物是由共同的原始祖先进化而来的。各种生物之间具有或近或远的亲缘关系。亲缘关系越近，则其对应的基因的碱基序列相似程度就越高，而基因控制蛋白质的合成，故其对应的蛋白质的氨基酸序列相似程度也高。因此，可以采用测定基因或蛋白质序列的方法进行判断。若蛋白质的相似程度高，则进行电泳时，电泳带的相似程度也高。不同动物的乳酸脱氢酶同工酶组成虽不同，但不能说明其pH就一定不同。
答案：D
13．解析：氨基酸是一种两性电解质，在一定pH条件下带电荷，作为带电粒子，氨基酸向与其自身所带电荷相反的电极运动，即向正极运动的氨基酸带负电荷，向负极运动的氨基酸带正电荷，在原点不动的氨基酸，所带正电荷和负电荷相等。蛋白质也是一种两性电解质。
答案：（1）赖氨酸 谷氨酸 氨基酸是一种两性电解质，在一定pH条件下带电荷，作为带电粒子，在进行电泳时氨基酸向与其自身所带电荷相反的电极方向运动
（2）不一样 进行电泳时，若氨基酸带相同的电荷数，相对分子质量越小，则移动越快。由于两者相对分子质量不相等，因此到达两极的速度不同
（3）蛋白质同氨基酸一样，在一定pH条件下带电荷，也会向与其自身所带电荷相反的电极方向运动
14．解析：（1）加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固。（2）透析的原理是小分子可以透出透析袋（半透膜），而大分子不能通过。
（3）电泳时，影响蛋白质迁移速率的因素有蛋白质分子的带电性质及分子的大小、形状等。
（4）SDS凝胶电泳主要取决于蛋白质分子量的大小，与电荷无关，同时加样在“－”极，通电后，样品蛋白质向“＋”极移动，分子量相对小的，移动距离大，因此从图一的电泳结果分析，P比N、M移向“＋”距离大，符合图二中的丙。
答案：（1）防止血液凝固 （2）小分子可以透出透析袋（半透膜），而大分子不能通过 （3）带电荷数多少 大小 （4）丙
教学建议
教师可从教材入手导入本节，也可以列举其他实例，说明蛋白质提取和分离的重要性。
电泳技术广泛应用于生化实验，在分离酶、蛋白质、核酸等生物大分子方面具有较高的分辨率。教师可以通过一个简单的实验使学生理解电泳现象，比如在盛有红褐色Fe（OH）3胶体的U形管的两个管口，各插入一个电极。通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐变深，阳极附近的颜色逐渐变浅。这表明Fe（OH）3胶体粒子带正电荷，在电场作用下向阴极移动。这种在外加电场作用下，带电粒子发生迁移的现象就叫做电泳。
在学生理解了电泳原理的基础上，教师可以联系必修一中蛋白质结构的知识，说明蛋白质是两性电解质，在一定pH条件下带有电荷，可进行电泳。
“血清蛋白的提取和分离”是在理解电泳原理的基础上安排的一个实验，在实验前教师要强调注意事项，以便保证实验成功。教师在实验前可以先培训每个小组的组长，然后各小组在组长的指导下进行实验。学业达标测评(十四)
一、选择题
1．在分离蛋白质过程中，使用缓冲液的作用是( )
A．维持溶液浓度不变
B．维持溶液酸碱度不变
C．催化蛋白质分离过程顺利完成
D．无实际意义
【答案】 B
2．在血清蛋白的提取和分离过程中，所使用的染色液是( )
A．新制血清5
μL
B．质量浓度为0.4
g/mL的蔗糖溶液
C．质量分数为0.05%的考马斯亮蓝R250染色液
D．质量分数为0.1%的溴酚蓝指示剂
【解析】 染色时用质量分数为0.05%的考马斯亮蓝R250染色液；A、B、D三者的混合液用于点样。
【答案】 C
3．在蛋白质的分离提纯技术中，最为简捷灵敏的是( )
A．离心技术
B．层析技术
C．电泳技术
D．盐析
【解析】 常用的蛋白质分离提纯技术，包括离心技术、层析技术和电泳技术等，其中电泳技术最为快捷灵敏、简便易行。盐析可用来提取蛋白质，而不能分离蛋白质。
【答案】 C
4．蛋白质具有多种特性，下列可用于进行蛋白质的分离提纯的是( )
A．分子的形状、大小和溶解度
B．所带电荷的性质和多少
C．对其他分子的亲和力
D．以上三项都是
【解析】 蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相反的电极方向移动。另外分子的形状、溶解度和对其他分子的亲和力等因素也会影响蛋白质的移动，因此可以将蛋白质分离。
【答案】 D
5．有一蛋白质被蛋白酶水解后进行电泳，结果如下图
(1)下列有关所带电荷的叙述错误的是( )
A．A、B、C三条带中的多肽均带正电荷
B．三条带中的多肽所带电荷数均相同
C．B、C两条带的差距可能因所带电荷引起，也可能是由分子大小导致
D．A带中可能有不同的多肽
(2)三条带的宽度不同，颜色由深到浅依次为B、C、A下列相关解释错误的是( )
A．A带中可能存在电荷相同，分子大小略有差异的几种多肽
B．宽度不同是因为含量不同造成的
C．带宽越窄，说明很可能只有一种多肽
D．颜色越深，说明此分子的含量越多
【解析】 (1)由图可知，A、B、C三条带出现说明多肽的移动速度不同，所带电荷越多，分子越小移动越快，所带电荷量相同，移动速度不一定相同，移动速度相同，也不一定是同一种多肽。
(2)电泳后，带宽是由移动速度是否相同决定的，电荷相同，分子大小也相同，移动速度就基本相同，表现为带就越窄。颜色是由分子的数量决定的，分子数越多，聚集在一起，颜色就越深。
【答案】 (1)B (2)B
6．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的是( )
A．若将样品以2
000
r/min的速度离心10
min，分子戊在沉淀中，则丙也一定在沉淀中
B．若用凝胶色谱法分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快
C．将样品装入透析袋中透析12
h，若分子丙保留在袋内，则乙也一定保留在袋内
D．若用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子丁形成的电泳带相距最远
【解析】 分子丙的相对分子质量大于戊，所以，在离心时戊存在于沉淀中，丙也一定在沉淀中，A项正确。用凝胶色谱法分离蛋白质时，甲相对分子质量最小，容易进入凝胶内部，则移动速度最慢，B项错误。分子丙的相对分子质量大于乙，则丙保留在袋内，乙可能在袋外也可能在袋内，C项错误。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移速度完全取决于分子的大小，因此，分子甲与丙形成的电泳带相距最远，D项错误。
【答案】 A
7．某同学在做血清蛋白的分离电泳实验时，等待电泳结果期间，因为有事未能及时赶回，当他回来时，发现凝胶上面只剩下一条带(比原来窄且颜色浅)，下列分析正确的是( )
A．电泳时间过长，多数蛋白质已经移出凝胶块
B．血清蛋白中只含一种蛋白质
C．血清蛋白中所含蛋白质的电荷都相同
D．他把电极接反了，未能进行电泳
【解析】 由题干可知电泳后的带比原来窄了而且颜色变浅，说明电泳已经进行了，凝胶上没有其他色带，说明一些蛋白质移出了凝胶(未及时赶回)。
【答案】 A
二、非选择题
8．电泳技术是在电场作用下，利用分子携带的净电荷不同，把待测分子的混合物放在一定的介质(如琼脂糖凝胶)中进行分离和分析的实验技术，利用它可分离氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等物质。下图是电泳装置及相应电泳结果。
请回答：
(1)电泳与叶绿素分离采用的纸层析法比较，后者使用的介质是________。电泳过程中分子的迁移速率除与本身所带净电荷的多少有关外，你认为还受什么因素的影响？(至少列出一种)_______________________________。
(2)图丙是把含有19个氨基酸的多肽进行水解，得到氨基酸混合物进行电泳的结果，故可推知该多肽是由________种氨基酸构成的。
(3)下列氨基酸若进行电泳应该在哪条带中？
【解析】 电泳与纸层析法的目的都是为了让不同分
子大小的物质分开，分子迁移速率大小与电荷多少、分子的大小和形状密切相关。观察图丙，结果有6条氨基酸带，说明有6种氨基酸分子。氨基酸中－NH2带正电，－COOH带负电，所以－NH2多的氨基酸向负极移动，－COOH多则向正极移动。
【答案】 (1)层析液 分子的大小、形状、凝胶的种类、密度、电场强度
(2)6 (3)①a ②b ③c ④d或e或f第一节 蛋白质的提取和分离
1．了解提取生物大分子的基本思路和方法。
2．尝试蛋白质的提取。
一、蛋白质分离提纯技术
将生物体内的蛋白质提取出来并加以分离，就可以得到高纯度的甚至是单一种类的蛋白质。
1．蛋白质分离提纯技术
包括离心技术、层析技术和电泳技术等。其中，电泳技术最为快捷灵敏、简便易行。
2．电泳原理
蛋白质含有游离的氨基和羧基，是两性电解质，在一定pH条件下带有电荷。作为带电粒子，蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相反的电极方向移动，这就是电泳现象。蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快；电荷数相同时，相对分子质量越小，则移动越快。
3．不同蛋白质的混合溶液，在经过同一个电场电泳后，会在凝胶上形成不同的带纹。每一种带纹可能就是一种蛋白质。将这些带纹一个一个地剪下来，分别予以洗脱，然后对洗脱液中的蛋白质做进一步的分离。如果待测洗脱液不能再分离，则这个带纹中很可能含有一种单纯蛋白质。如果待测洗脱液还能再分离，则这个带纹中含有多种蛋白质，需要作进一步分离，直至提纯。
二、血清蛋白的提取和分离
1．新鲜血液在体外凝固后，会析出清亮的淡黄色液体——血清。血清中含有丙种球蛋白、凝集素等多种蛋白质。
2．过程
（1）点样：取新制血清与蔗糖溶液及溴酚蓝指示剂等体积混匀后，小心加到电泳样品槽的胶面上。
（2）电泳。
（3）染色：取出凝胶，放入考马斯亮蓝R250染色液中。染色与固定同时进行，使染色液没过胶板，染色30
min。
（4）脱色：用醋酸溶液浸泡漂洗数次，每隔1～2
h更换脱色液，直至底色脱净，背景清晰。
（5）制干胶板：将已脱色的凝胶板放在保存液中浸泡3～4
h，然后放在两层透气玻璃纸中间，自然干燥即可获得血清蛋白的电泳谱带。
三、其他蛋白质的提取与分离
1．牛奶中酪蛋白的提取与检测
当pH＝4.8时，酪蛋白的溶解度降低，并析出沉淀。用酒精除去酪蛋白沉淀中的脂肪后，即得到纯的酪蛋白。
酪蛋白中含有酪氨酸，能与米伦试剂起颜色反应，首先生成白色沉淀，加热后变成红色。
2．卵清蛋白质的分离
选取鸡、鸭、鹅、鹌鹑等动物的新鲜卵清作实验材料。采用电泳法分离卵清蛋白质。
思考：可否利用蛋白质的提取与分离技术快速诊断早期癌变？
提示：可以。只需从早期患者的尿液、血液或细胞裂解液中提取少量蛋白质样品，采用蛋白质指纹图谱技术，就可以更加快速、简便、准确地对细胞癌变作出诊断。
1．电泳
许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电粒子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电粒子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
两种常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，在测定蛋白质相对分子质量时通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。而在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中，SDS能使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的相对分子质量；同时SDS所带的大量负电荷能掩盖不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
2．用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量时，可选用一组已知相对分子质量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知相对分子质量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和相对分子质量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的相对分子质量。
具体步骤如下：（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板；（2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备；（3）样品处理；（4）把凝胶固定于电泳装置上；（5）加样：按顺序加样，加样量通常为10～25
μL，样品可以多加几个；（6）电泳；（7）剥胶；（8）染色；（9）脱色；（10）观察结果。
SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。
由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMED和过硫酸铵对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定要按照实验要求和步骤，在老师的指导下完成。操作时要戴好一次性手套。
题型一
电泳技术的原理
【例题1】关于电泳的说法不正确的是（ ）。
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．带电粒子会向着与其所带电荷相反的电极移动
C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少
D．用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小
解析：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS
所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
答案：C
反思领悟：反思领悟：电泳利用了分离样品中各种分子带电性质不同以及分子本身的大小、形状不同，使带电粒子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
题型二
蛋白质的提纯
【例题2】（2011·广东理综）以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是（ ）。
A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂
B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少
C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移动慢
解析：大分子物质由于分子直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快，相反，分子质量较小的物质向下移动速度较慢。
答案：D
1
电泳过程中，什么样的分子迁移速度最快？（ ）
A．纤维状、大分子 B．纤维状、小分子
C．球状、大分子
D．球状、小分子
解析：电泳就是利用了连续分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同。一般来说，球状分子比纤维状分子易移动，小分子比大分子易移动。
答案：D
2
下面说法不正确的是（ ）。
A．分离胶和浓缩胶单独存在时具有神经毒性，应避免接触皮肤
B．电泳需要支持物，常用的是聚丙烯酰胺凝胶
C．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
D．透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内
解析：透析袋一般是用硝酸纤维素（又叫玻璃纸）制成的。透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。
答案：D
3
在盛有红褐色的Fe（OH）3胶体的U形管的两个管口，各插一个电极，通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐加深，这说明（ ）。
A．Fe（OH）3胶体粒子带负电荷，向阴极移动
B．Fe（OH）3胶体粒子带负电荷，向阳极移动
C．Fe（OH）3胶体粒子带正电荷，向阳极移动
D．Fe（OH）3胶体粒子带正电荷，向阴极移动
解析：该实验实际是电泳过程，在电场作用下，带电粒子会发生定向迁移，移向与所带电荷相反的电极。
答案：D
